体外培养细胞的染色体标本制备
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1.体外培养的细胞,在倒置镜下观察到有较多的分裂细胞(传代后24小时,圆形发亮的细胞)时,加入秋水仙素溶液,终浓度为0.3μɡ/ml培养液;
2.继续培养4小时;
3.胰酶消化收集细胞——>离心管;
4.离心1000转/每分钟,离心8分钟,去上清;
5.Hank's液洗,离心,去上清;
6.低渗处理:加入0.075M Kcl溶液10ml搅匀,37ºC置30分钟,用吸管稍吹打;
7.离心,去上清;
8.固定:加入固定液(甲醇:乙酸=3:1)10ml,沿管壁慢慢加入,吹打均匀,室温置15分钟;
9.重复步骤7、8;
10.离心,去上清;
11.加入少许(视细胞多少而定)新鲜固定液,制成细胞悬浮液;
12.滴片:(玻片要事先洗净,泡蒸馏水,置4ºC冰冻处理备用),火焰烘干或气干;
13.60ºC烤片14小时以上;
14.染色体G显带处理:A.片子经0.025%胰酶37°C处理约15-30秒(看具体情况而定)PH:±7.2;B.冲洗;C.染色10分钟(磷酸缓冲液PH7.2-7.4配Giemsa溶液);
15.晾干;
16.镜检分析;
17.显影摄影与核型分析。
注意:
1.秋水仙素加入时间不宜过长,太长染色体变短。
2.低渗时间稍短,太长细胞易破碎。
3.滴片越高越好,靠高度破裂细胞。
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